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黃曲霉毒素總量檢測試劑盒說明書
點(diǎn)擊次數(shù):2497 更新時間:2019-04-25

EF46A\K4                     2018-01

黃曲霉毒素總量

快速檢測試劑盒說明書

一、原理

本試劑盒采用間接競爭ELISA方法,在微孔條上預(yù)包被偶聯(lián)抗原,樣本中的殘留物黃曲霉毒素總量將和微孔條上預(yù)包被的偶聯(lián)抗原競爭抗黃曲霉毒素總量抗體,加入酶標(biāo)記物后,用TMB底物顯色,樣本吸光值與其所含殘留物黃曲霉毒素總量的含量成負(fù)相關(guān),與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出相應(yīng)殘留物黃曲霉毒素總量的含量。

二、試劑盒特性

  1. 試劑盒靈敏度:   0.02ppb
  2. 孵育溫度:       25
  3. 孵育時間:       30min15min
  4. 樣本檢測下限

飼料 大米、玉米、花生、組織、食用油··········· 2 ppb

  1. 交叉反應(yīng)率

黃曲霉毒素B1  ··································· 100%

黃曲霉毒素M1 ····································· 91.2%

黃曲霉毒素B2 ····································· 68.4%

黃曲霉毒素G1 ······································· 4.7%

黃曲霉毒素G2 ······································· 2.7%

  1. 樣本回收

飼料 大米、玉米、花生、組織、食用油 ······· 95±35%

  • 試劑盒組成

1

微量測試孔

每條8孔,一板12條

2

標(biāo)準(zhǔn)液×6瓶

(1ml/瓶)

0ppb

0.02ppb

0.06ppb

0.18ppb

0.54ppb

1.62ppb

3

酶標(biāo)記物

7ml

紅色帽

4

抗體工作液

7ml

藍(lán)色帽

5

底物A液

7ml

白色帽

6

底物B液

7ml

黑色帽

7

終止液

7ml

黃色帽

8

20X濃縮洗滌液

40ml

白色帽

9

20X濃縮復(fù)溶液

50ml

透明帽

四、所用儀器、試劑

具備的儀器:酶標(biāo)儀、均質(zhì)器、振蕩器、離心機(jī)、刻度移液管、天平(感量0.01g)、氮吹儀、恒溫箱、打印機(jī)

微量移液器:單道 20~200µl、單道100~1000µl、多道 30~300 µl

      劑:甲醇、正己烷

五、樣本前處理步驟

  1. 樣本處理前須知

(a)實(shí)驗中必須使用一次性吸頭,吸取不同試劑時要更換吸頭。

(b)實(shí)驗之前須檢查各種實(shí)驗器具是否干凈,必要時可對實(shí)驗器具進(jìn)行清潔,以避免污染干擾實(shí)驗結(jié)果。

  1. 樣本前處理需配制:

配液1  樣本復(fù)溶液: 

用去離子水將20×濃縮復(fù)溶液按1:19 

(1份20×濃縮復(fù)溶液+19份去離子水)。

配液2  樣本提取液: 

將甲醇與去離子水按7:3比例混合(7份甲醇+3份去離子水)

  1. 樣本處理:     

a組織、飼料、大米、玉米樣本處理方法:

  1. 取1.0±0.05g研碎的樣本于50ml離心管中;加入5ml樣本提取液,充分振蕩3min,20℃ 4000r/min以上離心10min;
  2. 取上清100µl,加入700µl樣本復(fù)溶液,充分振蕩混勻;
  3. 取50µl用于分析。

  樣本稀釋倍數(shù):40  

b食用油樣本處理方法:

  1. 取1.0±0.05g食用油樣本于50ml離心管中;加入5ml樣本提取液,再加入4ml正己烷,充分振蕩3min,20℃ 4000r/min以上離心10min;
  2. 去掉上清,取中間層液體100µl,加入700µl樣本復(fù)溶液,充分振蕩混勻;
  3. 取50µl用于分析。

  樣本稀釋倍數(shù):40   

c花生樣本處理方法:

  1.    取1.0±0.05g研碎的花生樣本于50ml離心管

     中;加入5ml樣本提取液,再加入4ml正己

     ,充分振蕩3min,20℃ 4000r/min以上離

     心10min;

  1.   去掉上清,取中間層液體100µl,加入400µl

    樣本復(fù)溶液,充分振蕩混勻;

3.   取50µl用于分析

    樣本稀釋倍數(shù)25  

六、 酶標(biāo)免疫分析程序:

  1. 測定前應(yīng)須知:
  1. 使用前將需用試劑和板條的溫度回升至室溫(20~25)。
  2. 使用之后立即將所有試劑放回2~8
  3. 在ELISA分析中的再現(xiàn)性,很大程度上取決于洗板的一致性,正確的洗板操作是ELISA測定程序中的要點(diǎn)。
  4. 所有恒溫孵育過程,避免光線照射,用蓋板膜蓋住微孔板。
  1. 操作步驟:
  1. 從2~8冷藏環(huán)境中取出所需試劑,室溫(20~25)平衡30min以上,注意每種液體試劑使用前均須搖勻。
  2. 取出框架及需要數(shù)量的微孔,將不用的微孔放入自封袋,保存于2~8。
  3. 配液:將40ml濃縮洗滌液(20倍濃縮)用去離子水按照1:19稀釋(1份濃縮洗滌液+19份去離子水),或按所需用量配制洗滌液
  4. 編號:將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)微孔按序編號,每個樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行,并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置。
  5. 加標(biāo)準(zhǔn)品/樣本50µl/孔到各自的微孔中,然后加酶標(biāo)記物50µl/孔,再加入50µl/孔的抗體工作液,用蓋板膜蓋板,輕輕振蕩混勻,25℃環(huán)境反應(yīng)30min。
  6. 將孔內(nèi)液體甩干,用稀釋后的洗滌液250µl/孔洗板4~5次,每次間隔15~30秒,用吸水紙拍干(拍干后未清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破)。
  7. 顯色:加入底物A液50µl/孔,再加入底物B液50µl/孔,輕輕振蕩混勻,25環(huán)境中避光顯色15min
  8. 測定:加入終止液50µl/孔,輕輕振蕩混勻,設(shè)定酶標(biāo)儀于450nm處(建議用雙波長450/630nm檢測,5min內(nèi)讀數(shù)),測定每孔OD值。

七、結(jié)果判定

結(jié)果判定有兩種方法,粗略判定可用第1種方法,定量判定用第2種方法。注意樣本吸光度值與其所含黃曲霉毒素總量量成負(fù)相關(guān)。

1、粗略判定:

用樣本的平均吸光度值與標(biāo)準(zhǔn)值比較即可得出其濃度范圍(ng/ml)。假設(shè)樣本1的吸光度值為0.3,樣本2的吸光度值為1.0,標(biāo)準(zhǔn)液吸光度值分別是:0ppb為2.243; 0.02pb為1.816;0.06ppb為1.415;0.18ppb為0.74;0.54ppb為0.313;1.62ppb為0.155。則樣本1的濃度范圍是0.54ppb~1.62ppb;樣本2的濃度范圍是0.06ppb~0.18ppb,乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中黃曲霉毒素總量實(shí)際濃度。

2、定量分析

(1)百分吸光率的計算,標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的吸光度值的平均值(雙孔)除以個標(biāo)準(zhǔn)(0標(biāo)準(zhǔn))的吸光度值,再乘以100%,即

百分吸光(%)=

B

×100%

B0

B—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值

B0—0ng/ml標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值

(2)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與計算

以標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率為縱坐標(biāo),以黃曲霉毒素總量標(biāo)準(zhǔn)品濃(ng/ml)的半對數(shù)為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中,從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對應(yīng)的濃度,乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中黃曲霉毒素總量實(shí)際濃度。

若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進(jìn)行計算,更便于大量樣本的準(zhǔn)確、快速分析。

八、 注意事項

  1. 室溫低于25℃或試劑及標(biāo)本未回到室溫(20~25℃)會導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的OD值偏低。
  2. 在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況,則會伴隨著標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性,重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作。
  3. 混合要均勻,否則會出現(xiàn)重復(fù)性不好的現(xiàn)象。
  4. 反應(yīng)終止液為2M硫酸,避免接觸皮膚。
  5. 不要使用過了有效日期的試劑盒;稀釋或攙雜使用會引起靈敏度、OD值變化;不要交換使用不同批號的盒中試劑。
  6. 不用的微孔板放進(jìn)自封袋重新密封;標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和無色的發(fā)色劑對光敏感,因此要避免直接暴露在光線下。
  7. 顯色液若有任何顏色表明變質(zhì),應(yīng)當(dāng)棄之。標(biāo)準(zhǔn)品1的吸光度值小于0.5時,表示試劑可能變質(zhì)。
  8. 該試劑盒理想反應(yīng)溫度為25℃,溫度過高或過低將導(dǎo)致檢測吸光度值和靈敏度發(fā)生變化。

九、儲藏條件和保質(zhì)期

  1. 儲藏條件:試劑盒于2~8保存,不要冷凍。
  2.  質(zhì) 期:該產(chǎn)品有效期為1年,生產(chǎn)日期見包裝盒。

提示:酶標(biāo)板真空包裝袋若有漏氣,酶標(biāo)板仍然正常有效,不影響實(shí)驗結(jié)果,請放心使用。

 

農(nóng)業(yè)部生物毒素檢測重點(diǎn)實(shí)室

聯(lián)合研制

 

 

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