過氧化物酶(POD)活性檢測試劑盒說明書
微量法
注意:正式測定之前選擇 2-3 個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定。
規(guī)格:100T/96S 產(chǎn)品內(nèi)容:
提取液:液體 100mL×1 瓶,4℃保存; 試劑一:液體 20mL×1 瓶,4℃保存;
試劑二:液體 0.2mL×1 瓶,4℃保存;用時加入 3mL 試劑一,現(xiàn)配現(xiàn)用,可 4℃保存一周; 試劑三:液體 3 mL×1 瓶,4℃保存。
產(chǎn)品說明:
POD(EC 1.11.1.7)廣泛存在于動物、植物、微生物中,可催化過氧化氫氧化酚類和胺類化合物,具有消除過氧化氫和酚類、胺類毒性的雙重作用。POD 在有過氧化氫存在的情況下,能使愈創(chuàng)木酚發(fā)生氧化,生成茶褐色物質(zhì),該物質(zhì)在 470nm 有最大光吸收。
需自備的儀器和用品:
可見分光光度計/酶標(biāo)儀、臺式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、微量玻璃比色皿/96 孔板、研缽、冰和蒸餾水
操作步驟:
一、粗酶液提?。?/span>
1、細(xì)菌、細(xì)胞或組織樣品的制備
收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi),離心后棄上清;按照每 500 萬細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 提取液,超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞(功率 20%,超聲 3s,間隔 10s,重復(fù) 30 次);8000g 4℃離心 10min,取上清,置冰上待測。
稱取約 0.1g 組織,加入 1mL 提取液進(jìn)行冰浴勻漿;8000g 4℃離心 10min,取上清,置冰上待測。
2、血清(漿)樣品:直接檢測。二、測定步驟:
1、 分光光度計或酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上,調(diào)節(jié)波長至 470nm,蒸餾水調(diào)零。
2、 測定前將試劑一、二和三在 37℃(哺乳動物)或 25℃(其它物種)放置 10min 以上。
3、 樣本測定表
試劑名稱(µL) | 測定管 |
試劑一 | 120 |
試劑二 | 30 |
試劑三 | 30 |
蒸餾水 | 60 |
樣本 | 5 |
在 EP 管中按順序加入上述試劑,立即混勻并計時,立即取 200µL 轉(zhuǎn)移至微量玻璃比色皿或 96
孔板中,記錄 470nm 下 30s 時的吸光值 A1 和 1min30s 后的吸光值 A2。計算?A=A2-A1。
POD 活性計算:
用微量玻璃比色皿測定的計算公式如下
1、按血清(漿)體積計算
單位定義:每 mL 血清(漿)在每 mL 反應(yīng)體系中每分鐘 A470 變化 0.01 定義為一個酶活力單位。
POD(U/mL)=?A÷0.01×V 反總÷V 樣÷T =4900×?A
2、按樣本蛋白濃度計算
單位定義:每 mg 組織蛋白在每 mL 反應(yīng)體系中每分鐘 A470 變化 0.01 定義為一個酶活力單位。
POD(U/mg prot)=?A÷0.01×V 反總÷(Cpr×V 樣)÷T =4900×?A÷Cpr 3、按樣本鮮重計算
單位定義:每 g 組織在每 mL 反應(yīng)體系中每分鐘 A470 變化 0.01 定義為一個酶活力單位。
POD(U/g 鮮重)=?A÷0.01×V 反總÷(W÷V 樣總×V 樣)÷T =4900×?A÷W 4、按細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量計算
單位定義:每 1 萬個細(xì)菌或細(xì)胞在每 mL 反應(yīng)體系中每分鐘 A470 變化 0.01 定義為一個酶活力單位。
POD(U/104 cell)=?A÷0.01×V 反總÷(500÷V 樣總×V 樣)÷T =9.8×?A
用 96 孔板測定的計算公式如下
1、按血清(漿)體積計算
單位定義:每 mL 血清(漿)在每 mL 反應(yīng)體系中每分鐘 A470 變化 0.005 定義為一個酶活力單位。
POD(U/mL)=?A÷0.005×V 反總÷V 樣÷T =9800×?A
2、按樣本蛋白濃度計算
單位定義:每 mg 組織蛋白在每 mL 反應(yīng)體系中每分鐘 A470 變化 0.005 定義為一個酶活力單位。
POD(U/mg prot)=?A÷0.005×V 反總÷(Cpr×V 樣)÷T =9800×?A÷Cpr 3、按樣本鮮重計算
單位定義:每 g 組織在每 mL 反應(yīng)體系中每分鐘 A470 變化 0.005 定義為一個酶活力單位。
POD(U/g 鮮重)=?A÷0.005×V 反總÷(W÷V 樣總×V 樣)÷T =9800×?A÷W 4、按細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量計算
單位定義:每 1 萬個細(xì)菌或細(xì)胞在每mL 反應(yīng)體系中每分鐘A470 變化 0.005 定義為一個酶活力單位。
POD(U/104 cell)=?A÷0.005×V 反總÷(500÷V 樣總×V 樣)÷T =19.6×?A
V 反總:反應(yīng)體系總體積,0.245mL;V 樣:加入樣本體積,0.005mL;V 樣總:加入提取液體積,1 mL;T:反應(yīng)時間,1 min;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本鮮重,g;500:細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù),500 萬。
注意事項:
1、 如一次測定的樣本數(shù)量較多,可將試劑一、二、三和蒸餾水按照比例混合,在 37℃(哺乳動物) 或
25℃(其它物種)放置 10min,測定時加入 240µL 即可。
2、 樣本測定值如果小于 0.005,可將反應(yīng)時間延長到 3-5 分鐘,計算時除以反應(yīng)時間即可;如果高于 0.5,可將樣本用提取液進(jìn)行稀釋。計算時乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)即可。
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