U251MG/TMZ+luc人類星形膠質(zhì)瘤耐替莫唑胺細(xì)胞
Human astroglioma resistant temozolomide cells ,U251 MG/TMZ+luc
貨號：YJ-h244（STR（U251MG鑒定））
價格： 3200.0
規(guī)格： 1*10 6
細(xì)胞介紹
該細(xì)胞由U251MG/TMZ細(xì)胞通過慢病毒轉(zhuǎn)染的方式攜帶Luc基因。
細(xì)胞特性
1）來源：U251MG/TMZ | 2）形態(tài)：上皮細(xì)胞樣，貼壁生長 |
3）含量：>1*10 6細(xì)胞數(shù) | 4）規(guī)格：T25瓶或者1mL凍存管包裝 |
5）用途：僅供科研使用。 |
細(xì)胞運輸、保存及注意事項
復(fù)蘇細(xì)胞 | 凍存細(xì)胞 | |
包裝 | 充液的T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶 | 1mL凍存管 |
運輸條件 | 常溫 | 干冰 |
保存方式 | 75%酒精消毒瓶壁，置于37℃恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱 | -80℃冰箱中保存過夜后轉(zhuǎn)入液氮/立即復(fù)蘇 |
※注意事項 | 1. 收到細(xì)胞后，若發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)瓶破損、漏液及細(xì)胞有污染；或凍存管有破損，融化、漏液等，請立即拍照并聯(lián)系我們。照片包括細(xì)胞培養(yǎng)瓶/凍存管外觀，顯微鏡下細(xì)胞照片（100倍，200倍各2張）； 2. 若收到的復(fù)蘇細(xì)胞有少量細(xì)胞脫落、飄起，可能由于運輸途中導(dǎo)致。請先于37℃恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置2~3h后，再進(jìn)行處理； 3. 復(fù)蘇細(xì)胞的充液培養(yǎng)基為不含藥物的維持培養(yǎng)基，血清濃度較低，收到細(xì)胞后請及時更換為完全培養(yǎng)基； 4. 建議收到細(xì)胞后，首先進(jìn)行擴(kuò)增（至少3代），并凍存部分細(xì)胞以備用。 5. 細(xì)胞傳代或凍存過程中，不可使用含有藥物的培養(yǎng)基。 | |
細(xì)胞培養(yǎng)試劑的配制
1）TMZ藥物的配制及保存
建議將TMZ藥物配制成16mg/mL的母液：即使用1mL DMSO溶液溶解16mg TMZ藥物，使其完全溶解。（若所購買的TMZ藥物規(guī)格為10mg，則加入625uL DMSO溶液，待其完全溶解即為16mg/mL母液）
注意：可根據(jù)用量配置藥物，并將藥物分裝保存，避免反復(fù)凍融導(dǎo)致藥物失效。溶解后的TMZ，4℃保存1周，-20℃保存1個月，-80℃保存6個月。
2）凍存液的配制
90%優(yōu)質(zhì)胎牛血清+10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配。
3）完全培養(yǎng)基的配制（推薦使用YJ-h244-001b）
成分 | 體積/濃度 |
優(yōu)質(zhì)胎牛血清 | 10% |
雙抗 | 1% |
16ug/mL TMZ | 0.1%母液（16mg/mL） |
DMEM培養(yǎng)基 | 補充至所需體積 |
細(xì)胞培養(yǎng)條件
氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%； 溫度：37℃，培養(yǎng)箱濕度為70%~80%。
細(xì)胞處理
1）凍存細(xì)胞的復(fù)蘇
將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入到含4~6mL完全培養(yǎng)基的離心管中混合均勻，1000rpm/min離心3~5min，棄去上清液。加入1mL完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞后，均勻鋪于含6~8mL完全培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶（或皿）中，置于37℃恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)。第二天顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況，2~3day換液。
注意：①細(xì)胞復(fù)蘇過程中，不可使用含有藥物的培養(yǎng)基。須在細(xì)胞完全貼壁，形態(tài)完全展開，生長狀態(tài)穩(wěn)定后，方可根據(jù)實驗需要添加TMZ藥物。若加藥后細(xì)胞生長狀態(tài)較為緩慢，可適當(dāng)降低TMZ的濃度，或使用不含TMZ的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)至細(xì)胞生長狀態(tài)較好時，再更換為所需的TMZ濃度；
②建議復(fù)蘇細(xì)胞時始終穿戴防護(hù)手套和面罩，避免凍存管因溫差較大而發(fā)生爆炸，造成人員傷害。
2）細(xì)胞傳代（建議以同等底面積的培養(yǎng)瓶/皿按照1：2比例傳代）
①待細(xì)胞密度達(dá)到80%~90%時，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
②棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細(xì)胞1次，吸凈殘余的PBS。
③加入適當(dāng)體積的0.25％（w / v）胰蛋白酶-0.53 mM EDTA于培養(yǎng)瓶中（T25瓶-1mL，其它培養(yǎng)器皿可覆蓋培養(yǎng)底面即可），置于37℃培養(yǎng)箱中消化2~5min，顯微鏡下觀察細(xì)胞細(xì)胞大部分變圓并脫落，即可輕拍培養(yǎng)瓶使細(xì)胞全部脫落。迅速拿回操作臺，加入2倍體積的、含10%FBS的培養(yǎng)基中止消化。
④將細(xì)胞懸液移入離心管中，1000rpm/min離心5min，棄去上清液。
⑤向細(xì)胞沉淀中加入1~2mL完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，輕吹混勻。將細(xì)胞懸液按1：1的比例均勻鋪于2個新的培養(yǎng)瓶/皿中，添加6~8mL完全培養(yǎng)基，置于37℃恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。第二天顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況，2~3day換液。
注意：細(xì)胞傳代過程中，不可使用含有藥物的培養(yǎng)基。須在細(xì)胞完全貼壁，形態(tài)完全展開，生長狀態(tài)穩(wěn)定后，方可根據(jù)實驗需要添加TMZ藥物。若加藥后細(xì)胞生長狀態(tài)較為緩慢，可適當(dāng)降低TMZ的濃度，或使用不含TMZ的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)至細(xì)胞生長狀態(tài)較好時，再更換為所需的TMZ濃度。
3）細(xì)胞凍存
①細(xì)胞凍存時，步驟同2）細(xì)胞傳代的①~④，細(xì)胞計數(shù)后，加入配制好的細(xì)胞凍存液，重懸細(xì)胞，按照1×106 ~ 1×107個細(xì)胞/mL分配到一個凍存管中，標(biāo)注好名稱、代數(shù)、日期等信息。
②將要凍存的細(xì)胞置于程序降溫盒中，-80℃冰箱中過夜，之后轉(zhuǎn)入液氮容器中儲存。同時記錄好凍存管在液氮容器中的位置以便后續(xù)查閱和使用。
細(xì)胞篩選
穩(wěn)定轉(zhuǎn)染luc的細(xì)胞，隨細(xì)胞傳代次數(shù)的增加，其luc熒光強度逐漸減弱。若要維持熒光強度，需加入嘌呤霉素進(jìn)行篩選。
初次進(jìn)行細(xì)胞篩選時，建議加入終濃度為1ug/mL嘌呤霉素的完全培養(yǎng)基維持培養(yǎng)，若無細(xì)胞漂浮或者漂浮較少，即可更換為含2ug/mL嘌呤霉素的完全培養(yǎng)基繼續(xù)篩選，以此類推，至最高藥物濃度為5ug/mL。若篩選過程中，漂浮細(xì)胞大于60%，則停止篩選，換成正常培養(yǎng)基培養(yǎng)，至細(xì)胞密度約80%，可繼續(xù)加入同濃度嘌呤霉素進(jìn)行篩選。當(dāng)加入5ug/mL嘌呤霉素時細(xì)胞正常增殖，可停止篩選，用不含藥完全培養(yǎng)基正常培養(yǎng)。
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