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E14 小鼠胚胎干細(xì)胞傳代/復(fù)蘇技巧
點擊次數(shù):358 更新時間:2024-07-06

E14 小鼠胚胎干細(xì)胞

Mouse Embryonic Stem Cells ,ES-E14TG2a

貨號:YJ-m062(種屬鑒定)

價格: 1800.0

規(guī)格: 1*106

細(xì)胞描述

小鼠胚胎干細(xì)胞。該細(xì)胞缺乏 HGPRTHPRT),并且對 0.06 mM 6-硫鳥嘌呤有抗性。當(dāng)在飼養(yǎng)層(胚胎成纖維細(xì)胞或 STO 細(xì)胞)上培養(yǎng)時,細(xì)胞保持未分化狀態(tài)。在沒有飼養(yǎng)層的情況下,細(xì)胞自發(fā)分化并形成胚胎結(jié)構(gòu)。當(dāng)注入胚泡中時,細(xì)胞可以進入生殖系。在常規(guī)的分子基因修飾技術(shù)之后,它們可用于重構(gòu)小鼠胚胎。培養(yǎng)時需使用昆明白MEF作為飼養(yǎng)層細(xì)胞。

細(xì)胞特性

1 來源:小鼠,129/Ola品系,胚胎內(nèi)細(xì)胞團

2 形態(tài):球形克隆 貼壁生長

3 含量:>1x10^6  細(xì)胞數(shù)

4 規(guī)格:1mL凍存管包裝

5 用途:僅供科研使用

運輸和保存

干冰運輸:1mL凍存管包裝干冰運輸,收到后-80度冰箱保存過夜后轉(zhuǎn)入液氮或直接復(fù)蘇,若發(fā)現(xiàn)干冰已揮發(fā)干凈、凍存管瓶蓋脫落、破損及細(xì)胞有污染,請立即與我們聯(lián)系。

一.培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準(zhǔn)備:

1)準(zhǔn)備DMEM 基礎(chǔ)培養(yǎng)基                      (YJ-0001)                                  81%      

優(yōu)質(zhì)胎牛血清                                            YJ-0500                              15 %

GlutaMAX-1谷氨酰胺                                ( YJ-0900 )                                1 %

MEM NEAA非必需氨基酸                         (YJ-01000)                                1%

Sodium Pyruvate丙酮酸鈉                         ( YJ-01100 )                                1%

P/S青霉素-鏈霉素                                  YJ-15140-122                         1%

β-巰基乙醇                                                  (YJ-8211)                                   0.5 mL1000X)

LIF                                                                (YJ-50756)                                 5μg10ng/mL

使用昆明白MEF作為飼養(yǎng)層細(xì)胞。

2)培養(yǎng)條件: 氣相:空氣,95%;二氧化碳,5%。 溫度:37℃,培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。

3)凍存液:完全培養(yǎng)液 60%%,FBS 30%%DMSO 10%%現(xiàn)用現(xiàn)配。

我?guī)靸龃鏁r,體積為 500 μl,預(yù)期存活率 70%,每支凍存管的細(xì)胞復(fù)蘇,3 4 天后,會形成 30 40 個克隆,建議復(fù)蘇至 1 T25 培養(yǎng)瓶中。

二:細(xì)胞處理:

MEF 細(xì)胞鋪制:

1. T25 培養(yǎng)瓶中加入 0.2%明膠,搖勻后覆蓋底面即可,于 37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱至少放置 15 min 以上。

2. 吸除 0.2%明膠,加入事先水浴加熱至 37℃MEF 完全培養(yǎng)液。一般地,一個 T25 培養(yǎng)瓶中加入 5 ml MEF 完全培養(yǎng)液。

3.  按實驗需要:小鼠胚胎干細(xì)胞使用 KM-r P3 MEF CF-1 P3 MEF;復(fù)蘇 MEF 細(xì)胞若干支。將凍存管從液氮中取出,置于37℃水浴中使之迅速融解,取出后拿到超凈臺內(nèi)用75%酒精擦拭凍存管旋口處及外壁,防止污染。

4. 將凍存管內(nèi)細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至含 2 ml MEF 完全培養(yǎng)液的 15 ml 離心管內(nèi),以1000 rpm,離心 5 min,離心后將上清液吸除,另加入新鮮的 MEF 完全培養(yǎng)液 1 ml,重懸后按照一個 T25 培養(yǎng)瓶鋪 1′10^6 MEF 細(xì)胞,平均加入到 T25 培養(yǎng)瓶中,輕輕搖勻后置于 37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱。24 h 以后可以傳入小鼠胚胎干細(xì)胞。

5.復(fù)蘇或傳代小鼠胚胎干細(xì)胞前,將 T25 培養(yǎng)瓶中的 MEF 完全培養(yǎng)液吸除,加入 2 ml 小鼠胚胎干細(xì)胞完全培養(yǎng)液輕輕沖洗一遍后吸除,加入新鮮的小鼠胚胎干細(xì)胞完全培養(yǎng)液待用。

復(fù)蘇:

1.將小鼠胚胎干細(xì)胞凍存管從液氮中取出,置于 37℃水浴中使之迅速融解,取出后拿到超凈臺內(nèi)用 75%酒精擦拭凍存管旋口處及外壁,防止污染。

2. 將凍存管內(nèi)細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至含 3-4 ml 小鼠胚胎干細(xì)胞完全培養(yǎng)液的 15ml 離心管內(nèi),以 1000 rpm,離心 5 min。

3. 離心后將上清液吸除,另加入新鮮的小鼠胚胎干細(xì)胞完全培養(yǎng)液 2 ml,吹打懸浮。

4. 重復(fù)吹打,制成單細(xì)胞懸液,盡量避免氣泡。

5.  轉(zhuǎn)移至 1 個已經(jīng)鋪好 MEF 細(xì)胞的 T25 培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。

6. 每天更換小鼠胚胎干細(xì)胞完全培養(yǎng)液。

傳代:

1. 一般在復(fù)蘇后第 2-3 天傳代,視克隆大小和密度而定

2. 吸除廢液。

3. PBS(不含鈣鎂離子)輕輕沖洗一遍。

4. 加入 1.0 ml 0.25%胰酶(含 EDTA)至培養(yǎng)瓶,輕輕晃動,使胰酶覆蓋底面,置于 37℃培養(yǎng)箱內(nèi)消化細(xì)胞。

5. 在顯微鏡下觀察,直至細(xì)胞層全部脫落(一般需要 1-2 min)。

6.  2 ml 小鼠胚胎干細(xì)胞完全培養(yǎng)液終止消化。

7.  1000 rpm,離心 5 min,棄上清。

8. 加入約 1 ml 小鼠胚胎干細(xì)胞完全培養(yǎng)液,多次輕輕吹打細(xì)胞, 制成單細(xì)胞懸液。

9. 加入足量的小鼠胚胎干細(xì)胞完全培養(yǎng)液,吹打混勻,細(xì)胞懸液分裝到鋪好 MEF 細(xì)胞的 T25 培養(yǎng)瓶中。一般地,一個 T25 培養(yǎng)瓶加入 5-6 ml 培養(yǎng)液。放入 37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。每天換液。

傳代比例:1:4-1:7

凍存:

1.按傳代的方法將細(xì)胞消化下來,制成細(xì)胞懸液。

2.  1000 rpm,離心 5 min,棄上清,逐滴加入已經(jīng)預(yù)冷的凍存液,懸浮細(xì)胞。

3. 按每支存管內(nèi)加入 500 ml 細(xì)胞懸液分裝到凍存管內(nèi),標(biāo)記細(xì)胞名稱、代數(shù)、凍存日期等基本信息。

4.將凍存管置于程序降溫盒內(nèi),-80℃過夜,轉(zhuǎn)入液氮。

凍存液配方:

小鼠胚胎干細(xì)胞完全培養(yǎng)液 60%,ES FBS 30%DMSO 10%

附:小鼠胚胎干細(xì)胞與 MEF 細(xì)胞分離的簡易方法(差速貼壁法):

1.培養(yǎng)中的小鼠胚胎干細(xì)胞,按傳代的操作方法將細(xì)胞用胰酶消化并吹打成單細(xì)胞懸液后,加入適量的提前溫育好的小鼠胚胎干細(xì)胞完全培養(yǎng)液重懸細(xì)胞, 吹打混勻,細(xì)胞懸液分裝到無 MEF 細(xì)胞的培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶(一般地,一個T25 培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)的小鼠胚胎干細(xì)胞,在一個 10 cm 培養(yǎng)皿中進行差速貼壁。不要事先鋪明膠,如鋪明膠則細(xì)胞貼壁速度過快無法有效分離小鼠胚胎干細(xì)胞與 MEF 細(xì)胞)中。

2. 培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶置于 37°C 培養(yǎng)箱內(nèi)靜置 1 小時。

3.  1 小時后,絕大部分 MEF 細(xì)胞已貼在培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶底面,而大部分小鼠胚胎干細(xì)胞仍然懸浮在培養(yǎng)液中。收取培養(yǎng)液,進行后續(xù)實驗。

注意事項

1.收到細(xì)胞后,若發(fā)現(xiàn)干冰已揮發(fā)干凈、凍存管瓶蓋脫落、破損及細(xì)胞有污染,請立即與我們聯(lián)系。

2.收到細(xì)胞先不開瓶蓋,瓶身擦拭酒精后放在培養(yǎng)箱靜置2-4小時(視細(xì)胞密度而定)穩(wěn)定細(xì)胞狀態(tài)。接著在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況,并對細(xì)胞進行不同倍數(shù)拍照(建議收細(xì)胞時就整體外觀拍一張照片,觀察培養(yǎng)基的顏色和是否有漏液情況,隨后在顯微鏡下拍下細(xì)胞狀態(tài),100*,200*各一張),觀察記錄細(xì)胞在運輸過程中是否有污染情況。作為我方進行銷售依據(jù)。

3.由于細(xì)胞狀態(tài)受環(huán)境、操作和運輸?shù)榷喾矫嬉蛩赜绊?,故本公司只保證客戶收到細(xì)胞后一周內(nèi)的細(xì)胞狀態(tài),故客戶需要售后時需出示收到細(xì)胞的時間證明及客戶提供收貨時間和發(fā)現(xiàn)問題后客服人員溝通的時間證明,期間間隔時間不能大于7天。

4.所有動物細(xì)胞均視為有潛在的生物危害性,必須在二級生物安全臺內(nèi)操作,并請注意防護,所有廢液及接觸過此細(xì)胞的器皿需要滅菌后方能丟棄。

2011年開始我們致力于在生命科學(xué)領(lǐng)域、生物醫(yī)學(xué)實驗技術(shù)及論文潤色服務(wù),協(xié)助客戶各類實驗服務(wù)及論文潤色十余年,是客戶您值得信賴的科研合作伙伴!

如果您受時間、試驗條件等限制而無法完成您的課題研究,歡迎您與我們聯(lián)系。

實驗技術(shù)服務(wù):



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