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磷脂酶 A2（phospholipase A2，PLA2）試劑盒說明書
微量法
注意：正式測定之前選擇2-3個預期差異大的樣本做預測定。
測定意義
磷脂酶A2（EC3.1.1.4）是磷脂sn-2位脂酰基水解酶，廣泛存在于動植物組織、細菌、細胞核分泌物中，參與脂肪消化，精子成熟、細胞信號傳遞、脂質過氧化修復、宿主反應等生理過程，在控制體內磷脂類物質平衡、調節(jié)機體新陳代謝、參與疾病的病理進程等方面發(fā)揮著及其重要的作用。
測定原理
磷脂酶A2作用于2-硫代十六酰乙基磷酸膽堿（HEPC）產生游離巰基，與DTNB反應生成黃色物質，在412nm處有特征吸收峰。
自備實驗用品及儀器
天平、超速冷凍離心機、研缽、紫外分光光度計/酶標儀、微量石英比色皿/96 孔板。
試劑組成和配制
提取液：液體 100mL×1 瓶，4℃保存。
試劑一：液體 100mL×1 瓶，4℃保存。
試劑二：液體 20mL×1 瓶，4℃保存。
試劑三：液體×5 瓶，-20℃避光保存。臨用前根據用量每瓶加入 1.8mL 試劑二充分混勻。(3天使用完)
樣品處理
1. 組織：按照質量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g，加入1mL提取液）加入提取液，冰浴勻漿后于 4℃，10000g 離心5min，取全部上清于4℃、100000g離心30min，棄上清，取沉淀溶于1mL試劑一。
2. 細胞：按照細胞數量（104個）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細胞加入1mL提取液），冰浴超聲波破碎細胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時間3min）；然后于4℃，10000g 離心5min，取全部上清于4℃、100000g 離心 30min，棄上清，取沉淀溶于1mL試劑一。
3. 血清：直接測定。
測定操作
對照管 | 測定管 | |
樣品（μL） | 20 | 20 |
試劑二（μL） | 180 | |
試劑三（μL） | 180 | |
充分混勻，37℃反應 10min，于微量石英比色皿/96 孔板，蒸餾水調零，測定 412nm 處吸光值，記為 A 對照管和 A 測定管，△A=A 測定管- A 對照管 | ||
計算公式
a. 用微量石英比色皿測定的計算公式如下
1．按照蛋白濃度計算
酶活性定義：每毫克蛋白每分鐘水解HEPC產生1nmol游離巰基所需的酶量為一個酶活力單位。
PLA2 活性（nmol/min/mg prot）= △A÷（ε×d）×V 反總÷（V 樣×Cpr）÷T
= 73.53×△A÷Cpr
2．按照樣本質量計算
酶活性定義：每克組織每分鐘水解HEPC產生1nmol游離巰基所需的酶量為一個酶活力單位。
PLA2 活性（nmol/min/g）= △A÷（ε×d）×V 反總÷（W×V 樣÷V 樣總）÷T
= 73.53×△A÷W
3. 細胞數量計算
酶活性定義：每104個細胞每分鐘水解HEPC產生1nmol游離巰基所需的酶量為一個酶活力
單位。
PLA2 活性（nmol/min/104cell）= △A÷（ε×d）×V 反總÷（V 樣×細胞數量÷V 樣總）÷T= 73.53×△A÷細胞數量
4 按照液體體積計算
酶活性定義：每毫升血清每分鐘水解HEPC產生1nmol游離巰基所需的酶量為一個酶活力單位。
PLA2 活性（nmol/min/mL）= △A÷（ε×d）×V 反總÷V 樣÷T= 73.53×△A
ε：TNB 消光系數，13600L/mol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V 反總：反應總體積，1mL；V 樣：反應體系中加入樣本體積，0.1mL；W：樣本質量，g；V 樣總：加入提取液體積，1mL；T：反應時間，10min
b. 用 96 孔板測定的計算公式如下
1．按照蛋白濃度計算
酶活性定義：每毫克蛋白每分鐘水解HEPC產生1nmol游離巰基所需的酶量為一個酶活力單位。
PLA2 活性（nmol/min/mg prot）= △A÷（ε×d）×V 反總÷（V 樣×Cpr）÷T
=147.06×△A÷Cpr
2．按照樣本質量計算
酶活性定義：每克組織每分鐘水解HEPC產生1nmol游離巰基所需的酶量為一個酶活力單位。
PLA2 活性（nmol/min/g）= （ε×d）×V 反總÷（W×V 樣÷V 樣總）÷T
= 147.06×△A÷W
3. 細胞數量計算
酶活性定義：每104個細胞每分鐘水解HEPC產生1nmol游離巰基所需的酶量為一個酶活力單位。
PLA2活性（nmol/min/104cell）= △A÷（ε×d）×V 反總÷（V樣×細胞數量÷V樣總）÷T=147.06×△A÷細胞數量
4 按照液體體積計算
酶活性定義：每毫升血清每分鐘水解HEPC產生1nmol游離巰基所需的酶量為一個酶活力單位。
PLA2 活性（nmol/min/mL）= △A÷（ε×d）×V 反總÷V 樣÷T
= 147.06×△A
ε：TNB 消光系數，13600L/mol/cm；d：比色皿光徑，0.5cm；V 反總：反應總體積，1mL；V 樣：反應體系中加入樣本體積，0.1mL；W：樣本質量，g；V 樣總：加入提取液體積，1mL；T：反應時間，10min
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